СОРБЕНТЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА.

Сорбент является важнейшей частью хроматографической системы, именно от его характеристик и типа зависит возможность разделения веществ. Большое значение для кинетических характеристик имеют размеры частиц. В классической колоночной хроматографии используются сорбенты с размерами частиц 30-200 мкм ,при высоте колонке 1 м. Однако главный недостаток крупно зернистых сорбентов – большая длина диффузии внутри зерен , в этом случае приходится применять небольшие скорости движения потока . Основной путь улучшения кинетических характеристик сорбента – уменьшение толщины активного слоя .Достичь этого можно двумя путями .Первый из них заключается в том ,что на неактивное ядро (стеклянный шарик) диаметром порядка 30 мкм наносят тонкий слой сорбента 1-2 мкм – такие сорбенты получили название поверхностно-пористых сорбентов. Колонки ,заполненные такими сорбентами не оказывали большого сопротивления потоку, но однако обладали и таким недостатком как малая сорбционная емкость, так как в значительной степени состояли из неактивного материала. Второй путь улучшения качества сорбента –уменьшение диаметра частиц вплоть до 3—10 мкм. такие сорбенты называют объемно-пористыми. Такие материалы уже создают значительное сопротивление, что приводит к необходимости применять давления порядка 400 атм. Однако при увеличении однородности частиц удается снизить рабочее давление до 50—150 атм. Несомненным достоинством объемно-пористых сорбентов является их большая емкость , что позволяет их использовать не только в аналитических целях, но и для препаративного разделения веществ. В качестве материалов сорбентов используют самые разные вещества природного происхождения и синтетические – органические и неорганические полимеры. Прежде всего это сорбенты на основе целлюлозы, агарозы, окиси алюминия, силикагели. При химической модификации сорбента ,введением каких—либо функциональных групп можно получить сорбент с требуемыми свойствами, сродством к определенным классам соединений. В частности так получают ионообменники, если функциональная группа ионогенна. К важнейшим характеристикам сорбента также можно отнести развитость поверхности , размер пор на его поверхности. Одним из самых распространенных сорбентов является силикагель, или его многочисленные модификации. Это определяется тем ,что силикагель можно легко модифицировать, можно легко получать частицы с заданным размером частиц, размером пор, разной удельной поверхностью и т.д., к тому же сорбенты на основе силикагеля механически прочны и химически стойки. Силикагель чаще других сорбентов используют в нормально—фазовой хроматографии, благодаря взаимодействию сорбатов с полярными силанольными Si—OH и силоксановыми группами Si—O—Si .Модифицируют силикагели с помощью органилгалогенсиланов – R3—Si—Cl ,R2—SiCl2,R—SiCl3 . Модификация происходит за счет взаимодействия ОН—групп силикагеля с галогенсиланом, в результанте чего к силикагелю присоединяется остаток силана с органическими радикалами, который и придает сорбенту необходимые специфические свойства, например анионообменник SAX: R=(CH2)3—NR3 .- сильный анионообменник, используемый для разделения кислот. В настоящее время существует широкий спектр сорбентов с самыми разными модификациями , как правило выбор модифицирующего лиганда зависит от свойств и строения разделяемых веществ. Так если R обладает хиральностью, то на сорбенте возможно будет разделять оптические изомеры. Однако следует иметь в виду, что сорбционные свойства материала могут меняться в зависимости от подвижной фазы (растворителя). Сорбенты гель-фильтрации. Поскольку практическая часть нашей работы связана с гель-фильтрацией, остановимся кратко на материалах, с помощью которых происходит процесс разделения. В гель-фильтрации используются в качестве сорбентов как материалы природного происхождения, модифицированные и обработанные соответствующим образом (основа как правило целлюлоза или агароза), так и разнообразные синтетические материалы (гели на основе поливинилацетата, полиакриламида). Также используют вещества неорганического происхождения- пористые стёкла и пористый силикагель. По отношению к растворителю гели разделяют на гидрофильные и гидрофобные. Гидрофильные гели активно взаимодействуют с водой , впитывая её, при этом они набухают. Гидрофильность им придают гидрофильные группы , находящиеся на поверхности гранул геля (например –OH ,-NH2 и некоторые другие). Гидрофобные гели не взаимодействуют с водой (не набухают) , зато могут хорошо набухать в органических растворителях. Гидрофильные гели могут быть превращены в гидрофобные, для этого их нужно обработать реагентом, который реагирует с поверхностными группами, меняя их природу. Также ещё гели делят на универсальные и специального назначения. Универсальные гели отличаются широким распределением пор по размеру , разделение на них может дать первичную, но очень ценную информацию. Также гели подразделяют на мягкие, полужёсткие и жёсткие ( все либо гидрофильные либо нет). Мягкие гели как правило органические вещества ,характеризуются высокой эффективностью, их фактор ёмкости (Vвн/Vсп ) равен 3. Полужёсткие гели получают полимеризацией , они обладают высокой проницаемостью , средней ёмкостью, мало увеличивают свой объём при набухании. Жёсткие- это как правило неорганические вещества, не способные набухать их фактор ёмкости в среднем 0.8-0.9. Теперь кратко рассмотрим наиболее распространённые гели. Полидекстрановые гели. Полидекстрановые гели типа сефадекс. Представляют собой довольно крупные молекулы пространственно разветвлённого декстрана. Хранится и перевозится в сухом виде. Окисление кислородом приводит к появлению новых карбоксильных групп, что в свою очередь становится причиной сорбции молекул вещества в неподвижной фазе. По ионообменному механизму ,это недопустимо при гель – фильтрации, поэтому водные элюенты следует деаэрировать. Сильные окислители разрушают необратимо сефадексы. Данный сорбент не растворяется в органических растворителях. Остатки борной кислоты могут образовывать комплексы с декстраном , что предполагает не использовать борную кислоту и её соли при хроматографическом процессе. Во влажном состоянии при нейтральном pH сефадексы можно стерилизовать при Т = 1100С. В сухом виде выдерживает Т = 1200С. Сефадексы фирмы “Pharmacia” имеют маркировку G, номер означает пористость матрицы, то есть номер по сути своей описывает количество воды в мл. , которое связывает 10 грамм сухого геля, По размерам сферических гранул различают следующие категории: “Coarse” (100 – 300 mkm ); “Medium” (50 – 150 mkm ); “Fine” (20 – 80 mkm ); “Super fine” (10 – 40 mkm ). В аналитическом варианте колоночной хроматографии использзуют – “Fine” и “Super fine”; “Medium” – для препаративных опытов; “Coarse” – для фракционирования свободным объемом. Аналогичные матрицы из сефадексы выпускает фирма “Reanal” (Г–10 - Г-200) и др. фирмы. Сефакрилы представляют собой декстран, сшитый N,N – метиленбисакриламидом. Они поставляются уже набухшими, в виде густой водной суспензии. Главным её достоинством по сравнению с сефадексой – это более высокая жесткость частиц, что позволяет вести хроматографический процесс при более больших скоростях. Сефакрилы более химически стойки по сравнению с сефадексами. что даёт вести регенерацию колонок с этим сорбентом путём длительной промывки 0.2 Н NaOH. В других свойствах данный сорбент похож на сефадексу. Основным производителем сефакрила является фирма “Pharmacia”. Выпускают 5 её типов с маркой S ( от S-200 до S-1000 ) все категории “Super fine”. Гели агарозы Сефароза представляет собой гель агарозы. Поставляется в виде суспензии, которую нельзя подсушивать. Гели её довольно жесткие, но менее чем у сефакрил. Гранулы сефарозы очень хрупкие и её нельзя использовать при Т выше 400С. Рабочий диапазон pH = 4 – 9. Её разрушают детергенты и 6М раствор гуанидинхлорида. Стерилизацию колонок с сефарозой ведут диэтилпирокарбонатом. В присутствии солей даже умеренное подкисление приводит к сужению пор и увеличению поверхности сорбции. Сефакрилы фирмы “Pharmasia” имеют тип В с номером, показывающим процентное содержание агарозы, Гель агарозы,сшитый дибромпропанолом, имеет тип GL, Аналогичные матрицы из сефарозы выпускает фирма “Bio-Rad Labs” ( биогели серии А), фирма “LKB” ( ультрогели серии А) и др. . Полиакриловые гели: Представляют собой акриламид, прошитый N,N – метиленбисакриламидом. Хранится и перевозится в сухом виде. Пористость геля определяется концентрацией полиакриламида. Рабочий диапазон pН = 3 – 8. Это нейтральный, гидрофильный гель для работы с водными растворителями. При кипячении в водных растворах буферов при рН около 7 уже происходит гидролиз амидов. Химически менее стоек, чем сефадекс. Колонки на его основе “медленнее”, чем соответственные из сефадексы. Выдерживает меньшее давление, чем сефадекс. Основной производитель – фирма “Bio-Rad Labs” (биогели серии Р и категории “Fine” ). Аналогичные сорбенты выпускают фирмы “LKB” (ультрогели серии АсА ) и др. фирмы.